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中药有效成份提取分离:结晶重结晶和分步结晶法

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结晶、重结晶和分步结晶法:鉴定中草药化学成分,研究其化学结构,必须首先将中草药成分制备成单体纯品。在常温下,物质本身性质是液体的化台物,可分别用分馏法或层析法进行分离精制。一般他说,中草药化学成分在常温下多半是固体的物质,都具有结晶他的通性,可以根据溶解度的不同用结晶法来达到分离精制的目的。研究中草药化学成分时,一旦获得结晶,就能有效地进一步精制成为单体纯品。纯化台物的结晶有一定的熔点和结晶学的特征,有利于鉴定。如果鉴定的物质不是单体纯品,不但不能得出正确的结论,还会造成工作上的浪费。因此,求得结晶并制备成单体纯品,就成为鉴定中草药成分、研究其分子结构重要的一步。

1.杂质的除去:中草药经过提取分离所得到的成分,大多仍然含有杂质,或者是混合成分。有时即使有少量或微量杂质存在,也能阻碍或延缓结晶的形成。所以在制备结晶时,必须注意杂质的干扰,应力求尽可能除去。有时可选用溶剂溶出杂质,或只溶出所需要的成分。有时可用少量活性炭等进行脱色处理,以除去有色杂质。有时可通过氧化铝,硅胶或硅藻土短柱处理后,再进行制备结晶。但应用吸附剂除去杂质时,要注意所需要的成分也可能被吸附而损失。此外,层析法更是分离制备单体纯品所常用的有效方法。

如果一再处理仍未能使近于纯品的成分结晶化,则可先制备其晶态的衍生物,再回收原物,可望得到结晶。例如游离生物碱可制备各种生物碱盐类,羟基化合物可转变成乙酸化物,碳基化台物可制备成苯踪衍生物结晶。美登碱在原料中含量少,且反复分离精制难以得到结晶,但制备成3一滇丙基美登碱结晶后,再经水解除去澳丙基,美登碱就能制备成为结晶。

2.溶剂的选择;制备结晶,要注意选择合宜的溶剂和应用适量的溶剂。合宜的溶剂,最好是在冷时对所需要的成分溶解度较小,而热时溶解度较大。溶剂的沸点亦不宜太高。一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙醋等。但有些化合物在一般溶剂中不易形成结晶,而在某些溶剂中则易于形成结晶。例如葛根素、逆没食子酸(ellagicacid)在冰醋酸中易形成结晶,大黄素(emodin)在吡啶中易于结晶,萱草毒素(hemerocallin)在N,N一二甲基甲酞胺(DMF)中易得到结晶,而穿心莲亚硫酸氢钠加成物在丙酮一水中较易得到结晶。又如蝙蝠葛碱通常为无定形粉未,但能和氯仿或乙醚形成为加成物结晶。

3.结晶溶液的制备:制备结晶的溶液,需要成为过饱和的溶液。一般是应用适量的溶剂在加温的情况下,将化合物溶解再放置冷处。如果在室温中可以析出结晶,就不一定放置于冰箱中,以免伴随结晶析出更多的杂质。

“新生态”的物质即新游离的物质或无定形的粉未状物质,远较晶体物质的溶解度大,易于形成过饱和溶液。一般经过精制的化合物,在蒸去溶剂抽松为无定形粉未时就是如此,有时只要加入少量溶剂,往往立即可以溶解,稍稍放置即能析出结晶。例如长春花总弱碱部分抽松后加入1.5倍量的甲醇溶解,放置后很诀析出长春碱结晶。又如蝙蝠葛碱在乙醚中很难溶解,但当其盐的水溶液用氨液碱化,并立即用乙醚萃取,所得的乙醚溶液,放置后即可析出蝙蝠葛碱的乙醚加成物结晶。

制备结晶溶液,除选用单一溶剂外,也常采用混合溶剂。一般是先将化合物溶于易溶的溶剂中,再在室温下滴加适量的难溶的溶剂,直至溶液微呈浑浊,并将此溶液微微加温,使溶液完全澄清后放置。例如J一细辛醚重结晶时,可先溶于乙醇,再滴加适量水,即可析出很好的结晶。又如自虎杖中提取水溶性的虎杖甙时,在已精制饱和的水溶液上添加一层乙醚放置,既有利于溶出其共存的脂溶性杂质,又可降低水的极性,促使虎杖俄的结晶化。自秦皮中提取七叶甙(秦皮甲素),也可运用这样的办法。

结晶过程中,一般是溶液浓度高,降温诀,析出结晶的速度也快些。但是其结晶的颗粒较小,杂质也可能多些。有时自溶液中析出的速度太快,超过化合物晶核的形成劝分子定向排列的速度,往往只能得到无定形粉未。有时溶液太浓,粘度大反而不易结晶化。如果溶液浓度适当,温度慢慢降低,有可能析出结晶较大而纯度较高的结晶。有的化合物其结晶的形成需要较长的时间,例如铃兰毒甙等,有时需放置数天或更长的时间。

4.制备结晶操作:制备结晶除应注意以上各点外,在放置过程中,最好先塞紧瓶塞,避免液面先出现结晶,而致结晶纯度较低。如果放置一段时间后没有结晶析出,可以加入极微量的种晶,即同种化合物结晶的微小颗粒。加种晶是诱导晶核形成常用而有效的手段。一般他说,结晶化过程是有高度选择性的,当加入同种分子或离子,结晶多会立即长大。而且溶液中如果是光学异构体的混合物,还可依种晶性质优先析出其同种光学异构体。没有种晶时,可用玻璃棒蘸过饱和溶液一滴,在空气中任溶剂挥散,再用以磨擦容器内壁溶液边缘处,以诱导结晶的形成。如仍无结晶析出,可打开瓶塞任溶液逐步挥散,慢慢析晶。或另选适当溶剂处理,或再精制一次,尽可能除尽杂质后进行结晶操作。

5.重结晶及分步结晶:在制备结晶时,最好在形成一批结晶后,立即倾出上层溶液,然后再放置以得到第二批结晶。晶态物质可以用溶剂溶解再次结晶精制。这种方法称为重结晶法。结晶经重结晶后所得各部分母液,再经处理又可分别得到第二批、第三批结晶。这种方法则称为分步结晶法或分级结晶法。晶态物质在一再结晶过程中,结晶的析出总是越来越快,纯度也越来越高。分步结晶法各部分所得结晶,其纯度往往有较大的差异,但常可获得一种以上的结晶成分,在未加检查前不要贸然混在一起。

6.结晶纯度的判定:化合物的结晶都有一定的结晶形状、色泽、熔点和熔距,一可以作为鉴定的初步依据。这是非结晶物质所没有的物理性质。化合物结晶的形状和熔点往往因所用溶剂不同而有差异。原托品碱在氯仿中形成棱往状结晶,熔点207℃;在丙酮中则形成半球状结晶,熔点203℃;在氯仿和丙酮混合溶剂中则形成以上两种晶形的结晶。又如N一氧化苦参碱,在无水丙酮中得到的结晶熔点208℃,在稀丙酮(含水)析出的结晶为77~80℃。所以文献中常在化合物的晶形、熔点之后注明所用溶剂。一般单体纯化合物结晶的熔距较窄,有时要求在0.5℃左右,如果熔距较长则表示化合物不纯。

但有些例外情况,特别是有些化合物的分解点不易看得清楚。也有的化合物熔点一致,熔距较窄,但不是单体。一些立体异构体和结构非常类似的混合物,常有这样的现象。还有些化合物具有双熔点的特性,即在某一温度已经全部融熔,当温度继续上升时又固化,再升温至一定温度又熔化或分解。如防己诺林碱在1760C时熔化,至200℃时又固化,再在2420C时分解。中草药成分经过同一溶剂进行三次重结晶,其晶形及熔点一致,同时在薄层层析或纸层层析法经数种不同展开剂系统检定,也为一个斑点者,一般可以认为是一个单体化合物。但应注意,有的化合物在一般层析条件下,虽然只呈现一个斑点,但并不一定是单体成分。例如鹿含草中主成分为高熊果砍,异高熊果甙极难用一般方法分离,经反复结晶后,在纸层及聚酞胺薄层上都只有一个斑点,易误认为单一成分,但测其熔点在115~125℃,熔距很长。经制备其甲醚后,再经纸层层析检定,可以出现两个斑点,异高熊果甙的比移值大于高熊果甙。又如水菖蒲根茎挥发油中的α一细辛醚和β一细辛醚,在一般薄层上均为一个斑点,前者为结晶,熔点63℃,后者为液体沸点296℃,用硝酸银薄层或气相层忻很容易区分。有时个别化合物(如氨基酸)可能部分地与层析纸或薄层上的微量金属离子(如Cu)、酸或碱形成络合物、盐或分解而产生复斑。因此,判定结晶纯度时,要依据具体情况加以分析。此外,高压液谱、气相层析、紫外光谱等,均有助于检识结晶样品的纯度。

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